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每周科普

时间: 2021-10-24 09:38:14 | 作者：生物生物 | 来源: 喜蛋文章网 | 编辑: admin | 阅读: 94次

每周科普

Northern Blot

诺瑟杂交（Northern blot） 是一种通过一系列步骤来检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过诺瑟杂交方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。它主要用于检测不同组织、器官和检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。

Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。

基本介绍

Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。

Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。“Northern blot”这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。Northern blot 在1977年由斯坦福大学James Alwine，David Kemp和George Stark发明。Northern blotting实际上依照比它更早发明的一项杂交技术Southern blot（依据生物学家 EdwinSouthern 名字来命名）来命名，Southern blot主要用来对DNA进行分析。

流程

首先需要从组织或细胞中提取总RNA ,或者再经过寡聚（dT）纯化柱进行分离纯化得到mRNA。然后RNA样本经过电泳依据分子量的大小对被分离，随后凝胶上的RNA分子被转移到膜上。膜一般都带有正电荷，核酸分子由于带负电荷可以与膜很好的结合。转膜的缓冲液含有甲酰胺，它可以降低RNA样本与探针的退火温度，因而可以减少高温环境对RNA降解。RNA分子被转移到膜上后须经过烘烤或者紫外交联的方法加以固定。被标记的探针与RNA探针杂交，经过信号显示后表明需检测的基因的表达。Northern blot实验中阴性对照可以采用已经过RT-PCR或基因芯片检测过的无表达的基因。

材料

电泳胶

Northernblot中最为常用的电泳胶是含有甲醛的琼脂糖凝胶，甲醛可以减少RNA的二级结构，电泳完成后的胶可经过EB染色后在紫外下检测RNA的质量。而对小分子的RNA 或者microRNA一般采用聚丙烯酰胺变性胶电泳。RNA电泳中可以依据核糖体RNA的大小大致判断条带的大小，28S RNA大小一般为5kb，18S RNA 大小一般为2kb。28S RNA 的亮度一般是18S 的两倍。

Norther blot中探针的序列需要和检测目的基因序列互补配对，探针可以是DNA、RNA或者其它的寡聚核苷酸，但最小的长度必须大于25bp，体外合成的RNA探针可以采用更高的退火温度来减少背景中的噪音。探针一般采用P或者地高辛来进行标记。杂交过后，可采用X胶片显色的方法来检测信号。

探针；分析基因的表达可以有很多种不同的方法，除northern blot 外还有RT-PCR、基因芯片、RNA酶保护实验等。基因芯片常和northern blot一起使用，但通常情况下，northernblot的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于它可在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化。与定量PCR的高灵敏度相比，northern blot显然要逊色不少，但northern blot较高的特异性可以有效的减少实验结果的假阳性。Northern blot 实验中一个主要的问题是存在RNA的降解，所以northern blot中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。同时，norther blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的伤害。

优缺点；Northern blot 的优势在于它可检测目的片段的大小、是否具有可变剪切出现、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经过一定的处理除去探针后还可保存很长时间再次杂交使用。

应用

1，Northern blot 可用来检测不同组织、器官；生物体不同发育阶段以及胁迫环境或病理条件下特定基因的表达样式。如northern blot被大量用于检测癌细胞中原癌基因表达量的升高及抑癌基因表达量的下降，器官移植过程中由于免疫排斥反应造成某些基因表达量的上升，Northern blot还可用来检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。

2，,RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法

<1>试剂

10×MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/LEDTApH8.0。

5×载样缓冲液：50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4%溴酚蓝。

甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。

20×SSC；

去离子甲酰胺；

50mmol/LNaOH(含10 mmol/L NaCl)；

0.1mol/LTris，pH7.5。

<2>步骤

[1]40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7 ml 10×MSE缓冲液，11.5ml甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。

[2]等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。

[3]使RNA变性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺10ml。

[4]55℃加热15min，冰浴冷却。

[5]加2 ml 5×载样缓冲液。

[6]上样、同时加RNA标记物（同位素（32P）dCTP）。

[7]60伏电泳过夜。

[8]取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。

[9]室温下将胶浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。

[10]室温下将胶浸到0.1mmol/L TrisHCl(pH7.5)中45min,使胶中和。

[11]20×SSC洗胶1h。

[12]20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。

[13]取出硝酸纤维素膜，80℃真空烘烤2h。

<3>注意事项

[1]严格遵守试验规则，务必准确。

[2]由于好多药品是有毒的，对人体有害，请注意自身安全，做好防护

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文章标签：自然科学教育  健康科普  科普医学
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